顯微鏡中的二向色鏡主要用于對(duì)于不同波長(zhǎng)光的分束。當(dāng)使用二向色鏡時(shí)，它不僅僅會(huì)影響光束的傳播方向，還會(huì)影響它的波前。我們制作濾光片的時(shí)候會(huì)鍍上薄膜來得到需要的過濾波段。涂層產(chǎn)生的應(yīng)力會(huì)導(dǎo)致基材的輕微彎曲或者曲率的不同。二向色鏡的彎曲對(duì)于反射的影響比透射大得多。對(duì)于透過二向色鏡的光束而言，彎曲僅僅會(huì)導(dǎo)致輕微的色散，導(dǎo)致光束有可以忽略的像差。這也就解釋了為什么傳統(tǒng)的熒光顯微鏡為什么不重視平整度這個(gè)參數(shù)，因?yàn)榘l(fā)射信號(hào)是透過二向色鏡的。二向色鏡的輕微彎曲雖然在傳統(tǒng)的光學(xué)系統(tǒng)上不會(huì)造成很明顯的影響，但是會(huì)對(duì)更先進(jìn)的顯微系統(tǒng)的成像造成不可忽視的負(fù)面影響。這也就促使著濾光片廠家研發(fā)出更加適合先進(jìn)顯微系統(tǒng)的平整濾光片。

彎折或者彎曲的二向色鏡對(duì)于反射或者透射光束的光斑尺寸以及形狀

彎曲的二向色鏡對(duì)于反射的光束具有聚焦的作用

對(duì)于任意一束從45°方向被二向色鏡反射的光束而言，二向色鏡自身的曲率都會(huì)導(dǎo)致光束有一個(gè)附加的聚焦作用，同時(shí)導(dǎo)致焦平面位置的改變。而聚焦點(diǎn)的大小或者形狀也會(huì)發(fā)生改變。誠(chéng)然我們可以通過改變探測(cè)器的位置來補(bǔ)償發(fā)射光束的焦平面位移，但是這會(huì)導(dǎo)致圖像質(zhì)量的損失。

光學(xué)器件的平整度可以通過每英寸器件對(duì)于633nm光的波分?jǐn)?shù)來標(biāo)示。二向色鏡的平整度的偏差主要是由于球面曲率的影響。球面曲率決定了二向色鏡反射光束的焦平面偏移。當(dāng)使用高斯光束的時(shí)候，聚焦的質(zhì)量由瑞利范圍判斷，瑞利范圍指的是指光束沿著其行進(jìn)方向，從原始聚焦點(diǎn)到其面積為原始聚焦點(diǎn)面積兩倍的截面的距離，此時(shí)截面半徑約為1.414倍的聚焦點(diǎn)半徑。光束（或者一個(gè)成像點(diǎn)）在聚焦點(diǎn)的一個(gè)瑞利范圍內(nèi)仍然可以視為是聚焦的，這使其成為評(píng)判二向色鏡曲率的一個(gè)有效的指標(biāo)。如果聚焦點(diǎn)的偏移小于一個(gè)瑞利范圍，我們便可以忽略這個(gè)誤差。

如果二向色鏡存在彎曲，當(dāng)它以45°角反射時(shí)，產(chǎn)生的主要相差是散光，這會(huì)導(dǎo)致其在不同的方向（橫向和縱向）產(chǎn)生兩個(gè)不同的非對(duì)稱的焦點(diǎn)。雖然光束沒有完全的聚焦，但是我們可以在兩個(gè)焦點(diǎn)之間找到一個(gè)折中—即在圖像和更大焦斑之間成為模糊的中點(diǎn)中找到，這個(gè)點(diǎn)我們一般稱之為最小模糊圈。

由于二向色鏡的曲率導(dǎo)致反射產(chǎn)生兩種不同的焦點(diǎn)，中點(diǎn)是“最小模糊圈”

如果二向色鏡的曲率變大的話，散光的影響也會(huì)變小。以直徑為11 mm的光束為例，當(dāng)二向色鏡的曲率半徑大于150m的時(shí)候橫向和縱向的焦點(diǎn)就會(huì)非常相似。我們可以通過二向色鏡的曲率半徑（R）和成像透鏡的焦距（fTL）計(jì)算得到最小模糊圓的幾何尺寸半徑。對(duì)于非常大的曲率半徑而言，光束尺寸的增長(zhǎng)只會(huì)引起很小的散光。

當(dāng)散光是相差的主導(dǎo)因素時(shí)，三階或者更高階的像差也會(huì)在聚焦或者成像的透鏡后面降低準(zhǔn)直光束的質(zhì)量。而二向色鏡更加平整的話，會(huì)有效的降低最小模糊圈的大小。

在TIRF中，二向色鏡反射照明和激發(fā)光束到達(dá)樣品，所以二向色鏡的平整度會(huì)對(duì)光束質(zhì)量產(chǎn)生影響。二向色鏡更加平整的話，可以提供在樣品表面更加均一的照明，降低背景噪音。如果TIRF的照明光束很小，比如直徑只有數(shù)毫米或者更小，二向色鏡的曲率半徑對(duì)于理想的聚焦光束的形狀和尺寸影響不大。而焦點(diǎn)的位置則不同，當(dāng)激光在TIRF顯微鏡上被二向色鏡反射的時(shí)候，光束必須被物鏡的背焦平面反射。彎曲的二向色鏡會(huì)改變焦平面，所以如果顯微鏡中對(duì)于激光準(zhǔn)直的調(diào)節(jié)不夠精確，這很難達(dá)到成功的TIRF激發(fā)。而TIRF技術(shù)是諸如PALM和STORM這樣的超分辨成像技術(shù)的基礎(chǔ)，所以以TIRF技術(shù)為基礎(chǔ)的種種超分辨成像技術(shù)都有對(duì)于高平整度二向色鏡的需求。下圖就是使用Semrock超平二向色鏡構(gòu)建的多波長(zhǎng)STORM系統(tǒng)。

使用Semrock超平二向色鏡構(gòu)建的多波長(zhǎng)STORM系統(tǒng)

不僅僅是TIRF顯微，對(duì)于具有寬波段以及激光激發(fā)的結(jié)構(gòu)照明顯微鏡，因?yàn)槊砂灞仨氃诩ぐl(fā)光照射在樣品的光路上成像，所以對(duì)于焦平面位移的補(bǔ)償可能會(huì)帶來問題。如果二向色鏡的平整度不夠的話，由于照明成像光束的劣化，會(huì)導(dǎo)致網(wǎng)格無法在樣品表面成像，或者得到一個(gè)質(zhì)量足夠好的超分辨圖像。下圖就是中國(guó)科技大學(xué)的儲(chǔ)開芹老師使用Semrock超平濾光片構(gòu)建的SIM系統(tǒng)。

如果考慮實(shí)際的應(yīng)用，因?yàn)榻蛊矫嫖灰埔约吧⒐鈺?huì)因?yàn)楣馐叽绲脑黾佣黾樱馐叽缭诖_定我們需要的平整度時(shí)扮演了一個(gè)很重要的角色。某種濾光片或許對(duì)于使用較小光束的科研工作者是一個(gè)足夠平整的濾光片，但是對(duì)于另外的科研工作者而言，由于其使用的光束直徑較大，也許就不再適用。

采用Semrock超平濾光片的SIM系統(tǒng)

不同平坦度的二向色鏡的干涉儀條紋圖案（從左到右：3λ，1λ，λ/ 5 P-V RWE @ 633）。最終的平整度取決于涂膜應(yīng)力，基材不規(guī)則性和機(jī)械安裝應(yīng)力。

 

由于使用TIRF和超分辨顯微鏡，或者使用科研工作者自己開發(fā)的高性能顯微鏡系統(tǒng)都是有使用更大光束的趨勢(shì)，所以濾光片的平整度正在變得更加重要。Semrock全新改進(jìn)的Brightline?二向色鏡為這些應(yīng)用提供了兩種業(yè)界優(yōu)秀的解決方案：在厚度為1mm或者3mm的基材上具有同樣的光譜表現(xiàn)。

Semrock可以提供裝配好的濾光片盒

在1mm厚的基材上，Semrock把激光二向色鏡經(jīng)過了重新設(shè)計(jì)，可以達(dá)到λ/2的PV平整度。這樣的平整度可以讓直徑為10mm的光束在反射的時(shí)候產(chǎn)生的偏移不超過一個(gè)瑞利范圍。超平的1mm厚二向色鏡可以使用在標(biāo)準(zhǔn)的顯微鏡色塊里面，同時(shí)還簡(jiǎn)化了在色塊與最小化的光束之間的透過轉(zhuǎn)換，這也就避免了在1mm與2mm的二向色鏡之間轉(zhuǎn)換的重新校準(zhǔn)的問題。

當(dāng)使用二向色鏡時(shí)，安裝的時(shí)候鏡片可能會(huì)遇到很大的壓力，從而降低了二向色鏡的平整度，因此安裝二向色鏡的時(shí)候需要保持好二向色鏡的平整度。在3mm厚的基材上，Semrock可以提供λ/10平整度的成品，這樣可以使22.5mm直徑的光束的偏移不超過1個(gè)瑞利范圍。這些3mm厚的二向色鏡是設(shè)計(jì)高質(zhì)量超分辨顯微鏡系統(tǒng)的科研工作者的首選，因?yàn)樗麄冃枰酶蟮墓馐鴣淼玫嚼硐氲膱D像質(zhì)量。下表就是Semrock不同標(biāo)準(zhǔn)的二向色鏡。

參考文獻(xiàn)

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